Dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA)

Dr Raphaël Roduit

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1. Étude protéomique dans la DMLA réfractaire

Le traitement standard de la dégénérescence maculaire néovasculaire liée à l’âge (DMNA) consiste en des facteurs de croissance endothéliaux anti-vasculaires intravitréens (VEGF). Cependant, pour certains patients, même un traitement anti-VEGF maximal ne supprime pas entièrement l’activité exsudative. L’objectif de cette étude était d’identifier les biomarqueurs moléculaires dans la DMNA ayant une réponse incomplète au traitement anti-VEGF.

Des échantillons d’humeur aqueuse (AH) ont été recueillis auprès de trois groupes de patients : 17 patients atteints de MAAN répondant incomplètement aux anti-VEGF (18 yeux), 17 patients atteints de MAAN avec une réponse normale au traitement (21 yeux), et 16 patients témoins sans aucune rétinopathie (16 yeux). Des analyses protéomiques et multiplex ont été effectuées sur ces échantillons.

Les analyses protéomiques ont montré que les patients atteints d’AMN ayant une réponse anti-VEGF incomplète présentaient une réponse inflammatoire, une activation du complément, une cytolyse, un complexe protéino-lipidique et des voies de développement vasculaire accrus. Les analyses multiplexes ont révélé une augmentation significative des niveaux de la molécule d’adhésion cellulaire vasculaire soluble 1 (sVCAM-1) [p=0,001], de l’interleukine 6 (IL-6) [p=0,009], de l’interleukine 12 bioactive (IL-12p40) [p=0,03], de l’inhibiteur de l’activateur du plasminogène de type 1 (PAI-1) [p=0,004] et du facteur de croissance des hépatocytes (HGF) [p=0,004] chez les patients ayant une réponse incomplète par rapport aux patients ayant une réponse normale (Figure ci-dessous). Il est intéressant de noter que les mêmes biomarqueurs ont montré une intercorrélation élevée avec des valeurs de r2 comprises entre 0,58 et 0,94. En outre, nous avons confirmé par AlphaLISA l’augmentation du sVCAM-1 [p<0,0001] et de l’IL-6 [p=0,043] dans le groupe des répondeurs incomplets. Les répondeurs incomplets dans la nAMD sont associés à des voies angiogéniques et inflammatoires activées. L’activité exsudative résiduelle de l’AMDN malgré un traitement anti-VEGF maximal peut être liée aux réponses angiogéniques et inflammatoires nécessitant un traitement adjuvant spécifique.

Figure 1: Analyse multiplex. l’HA des patients atteints de DMLA avec réponse normale (N), réponse incomplète (R) et témoins (C) est analysée. Représentation graphique du sVCAM-1, PAI-1, HFG, IL-12p40 et IL-6. Les résultats sont exprimés en moyenne SEM et en % du groupe de contrôle (* p < 0.05, ** p<0.005, and # p<0.0005).

2. Décrypter le rôle de MAPK6/ERK3 dans les cellules photoréceptrices

Les cellules eucaryotes peuvent répondre à une grande variété de stimuli par l’activation de voies de signalisation spécifiques. Parmi elles, les voies des protéines kinases activées par les mitogènes (MAPK) qui jouent un rôle essentiel dans la prolifération et la différenciation des cellules, l’adaptation au stress environnemental, l’apoptose et la morphogenèse embryonnaire. Il existe deux types différents de MAPK : les MAPK classiques [kinase extracellulaire régulée par le signal (ERK) 1/2/5, kinases p38 et kinase terminale c-Jun (JNK) 1/2/3] et les MAPK atypiques [(ERK3/4, ERK7 et kinase némo-like (NLK)]. L’ERK3 est exprimée de manière omniprésente dans les tissus des mammifères adultes, l’expression la plus élevée se situant dans le cerveau. L’activation d’ERK3 reste mal caractérisée et, à ce jour, aucun stimuli n’a été trouvé pour favoriser sa phosphorylation. En outre, aucune fonction claire n’a été décrite pour la kinase jusqu’à présent, mais certains indices suggèrent un rôle potentiel dans le développement embryonnaire, la régulation du cycle cellulaire et la survie, la sénescence des tumeurs et l’architecture épithéliale.

Nous avons obtenu de nouvelles données préliminaires intéressantes montrant une forte expression de la kinase dans la rétine (souris et humain) et suggérant un rôle dans les photorécepteurs (cônes et bâtonnets) et/ou les cellules épithéliales pigmentées de la rétine (RPE). Nous n’avons pas vu d’études sur ERK3 dans la rétine ; nous avons donc prévu, dans ce projet, de décrypter le rôle d’ERK3 dans les rétines de poisson-zèbre et de souris. Nous voulons également déterminer son expression dans la rétine de patients atteints de maladies oculaires et sa fonction dans les EPR dérivées de cellules souches pluripotentes induites (IPS) humaines.

La découverte de la fonction d’ERK3 sera un véritable défi, et l’identification de substrats supplémentaires d’ERK3 nous aidera à mieux caractériser les fonctions biologiques de cette kinase et les voies de signalisation dans lesquelles elles sont impliquées. De plus, des études récentes impliquent ERK1/2 dans la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), et nous avons récemment publié une étude montrant la caractérisation d’un modèle de souris où l’ablation spécifique d’ERK1/2 dans les cellules RPE entraîne la mort des cellules RPE et la dégénérescence de la rétine.

Nous pensons que ERK3, en raison de sa grande similarité avec ERK1/2 et de sa forte expression rétinienne, spécifiquement dans les cellules photoréceptrices et EPR, pourrait également jouer un rôle essentiel dans la maladie de la rétine et de la DMLA. Nous espérons que le décryptage du rôle d’ERK3 dans la rétine, apportera une percée dans la recherche en santé, plus particulièrement dans le domaine de l’ophtalmologie.

Figure 2 : Immunohistochimie de la rétine du poisson zèbre. A) Coloration Erk3 (rouge) des cônes (C) et des bâtonnets (R) dans la rétine adulte. Un contrôle négatif sans anticorps primaire est montré. B) Co-localisation de Erk3 (rouge) avec Zpr-1 (vert), un marqueur des photorécepteurs des cônes verts/rouges et avec Zpr-3 (vert), un marqueur des photorécepteurs des bâtonnets.

Age related macular degeneration (ARMD)

Dr Raphael Roduit

1. Proteomic study in refractory ARMD

The standard treatment for neovascular age-related macular degeneration (nAMD) consists of intravitreal anti-vascular endothelial growth factors (VEGF). However, for some patients, even maximal anti-VEGF treatment does not entirely suppress exudative activity. The goal of this study was to identify molecular biomarkers in nAMD with incomplete response to anti-VEGF treatment.

Aqueous humor (AH) samples were collected from three groups of patients: 17 patients with nAMD responding incompletely to anti-VEGF (18 eyes), 17 patients affected by nAMD with normal treatment response (21 eyes), and 16 control patients without any retinopathy (16 eyes). Proteomic and multiplex analyses were performed on these samples.

Proteomic analyses showed that nAMD patients with incomplete anti-VEGF response displayed an increased inflammatory response, complement activation, cytolysis, protein-lipid complex, and vasculature development pathways. Multiplex analyses revealed a significant increase of soluble vascular cell adhesion molecule-1 (sVCAM-1) [p=0.001], interleukin-6 (IL-6) [p=0.009], bioactive interleukin-12 (IL-12p40) [p=0.03], plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1) [p=0.004], and hepatocyte growth factor (HGF) [p=0.004] levels in incomplete responders in comparison to normal responders. Interestingly, the same biomarkers showed a high intercorrelation with r2 values between 0.58 and 0.94. In addition, we confirmed by AlphaLISA the increase of sVCAM-1 [p<0.0001] and IL-6 [p=0.043] in the incomplete responder group.

Figure 1: Multiplex analysis. AH from nAMD patients with normal response (N), incomplete response (R), and controls (C) have been tested by multiplex. Graphic representation of sVCAM-1, PAI-1, HFG, IL-12p40, and IL-6. Results are expressed as mean ± SEM and as % of the control group (* p < 0.05, ** p<0.005, and # p<0.0005).

2. Deciphering the role of MAPK6/ERK3 in photoreceptor cells

Eukaryotic cells can respond to a wide variety of stimuli by the activation of specific signaling pathways. Among them, the mitogen-activated protein kinases (MAPKs) pathways that have a pivotal role in cell proliferation and differentiation, adaptation to environmental stress, apoptosis, and embryonic morphogenesis. There are two different types of MAPKs: the conventional [extracellular signal-regulated kinase (ERK) 1/2/5, p38 kinases and c-Jun terminal kinase (JNK) 1/2/3)] and the atypical [(ERK3/4, ERK7 and nemo like kinase (NLK)] MAPKs. ERK3 is expressed ubiquitously in adult mammalian tissues, with the highest expression in the brain. ERK3 activation remains poorly characterized and, to date, no stimuli have been found to promote its phosphorylation. Moreover, no clear function has been described for the kinase so far, but some clues suggest a potential role in embryonic development, cell cycle regulation and survival, tumor senescence, and epithelial architecture.

We obtained new interesting preliminary data showing strong expression of the kinase in the retina (mouse and human) and suggesting a role in photoreceptor (cones and rods) or/and retinal pigmented epithelial (RPE) cells. We saw no studies of ERK3 in the retina; therefore, we planned, in this project, to decipher the role of ERK3 in zebrafish and mouse retinas. We also want to determine its expression in the retina of patients affected by ocular diseases and its function in RPE derived from human induced pluripotent stem (IPS) cells.

The finding of ERK3 function will be a real challenge, and the identification of additional substrates of ERK3 will help us to characterize better the biological functions of this kinase and the signaling pathways in which they are involved. Moreover, recent studies, implicate ERK1/2 in age-related macular degeneration (ARMD), and we recently published a study showing the characterization of a mouse model where the specific ablation of ERK1/2 in RPE cells leads to RPE cell death and retinal degeneration.

We think that ERK3, because of its high similarity to ERK1/2 and its high retinal expression, specifically in photoreceptor and RPE cells, could also play an essential role in the retina and ARMD disease. We hope that deciphering the role of ERK3 in the retina, will bring a breakthrough in health research, more particularly in the field of ophthalmology.

Immunostaining of zebrafish retina. A) Erk3 staining (red) of cones (C) and rods (R) in adult retina. Negative control without primary antibody is shown. B) Co-localization of Erk3 (red) with Zpr-1 (green), a marker of green/red cone photoreceptors and with Zpr-3 (green), a marker of rod photoreceptors.

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