Rétinopathie diabétique (RD)

Raphael Roduit

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1. Rôle du GSH (Glutathion) dans la mort cellulaire et les défauts d’autophagie lors de l’hypoglycémie

Le glucose est le substrat métabolique le plus important de la rétine et le maintien de la normoglycémie est un défi essentiel pour les patients diabétiques ainsi que pour les individus. Les excursions glycémiques pourraient entraîner des maladies cardiovasculaires, des néphropathies, des neuropathies et des rétinopathies. Il existe une vaste littérature sur l’hyperglycémie, notamment dans le domaine de la rétinopathie diabétique, mais on sait très peu de choses sur les effets délétères de l’hypoglycémie. C’est pourquoi nous avons décidé d’étudier le rôle de l’hypoglycémie aiguë dans la rétine de souris. Nous avons récemment montré dans deux études différentes, que l’hypoglycémie induisait la mort des cellules rétiniennes chez la souris (Emery et al., 2011) et que les conditions de faible glucose sont associées à des défauts d’autophagie dans les cellules photoréceptrices 661W et les explants rétiniens (Balmer et al., 2013).

 En utilisant un clamp hyperinsulinémique/hypoglycémique comme paradigme, nous avons montré que l’hypoglycémie induisait la mort des cellules rétiniennes chez la souris via l’activation de la caspase 3 et la diminution du glutathion (GSH). Des expériences in vitro sur des cellules photoréceptrices de 661W ont confirmé l’induction de la mort à faible teneur en glucose par la production de superoxyde et l’activation de la caspase 3, qui était concomitante à une diminution de la teneur en GSH. De plus, la diminution de la teneur en GSH par traitement avec de la buthionine sulphoximine (BSO) à un taux de glucose élevé a induit l’apoptose, tandis que la complémentation avec de l’ester éthylique de glutathion extracellulaire (GSHee) a restauré le taux de GSH et réduit l’apoptose (Emery et al., 2011). De plus, nous avons déchiffré le mécanisme conduisant à la mort cellulaire en montrant le rôle du rapport BCL2/BAX dans ce processus. De plus, nous avons montré une activation du flux autophagique via l’AMPK/RAPTOR/mTOR et un défaut dans le processus de fusion lysosome/autophagosomes. Nous avons également souligné le rôle protecteur de l’autophagie dans la mort cellulaire induite par le glucose. En fait, l’inhibition de l’autophagie, qu’elle soit chimique ou génétique, sensibilise la cellule à la mort cellulaire induite par un faible taux de glucose. Nous suggérons que l’autophagie est activée dans les cellules photoréceptrices affectées par un faible taux de glucose afin de les protéger de l’apoptose ou de la nécrose. Malheureusement, le faible glucose affecte également la dégradation ou la fusion lysosomale via une diminution de l’expression de LAMP2a. Cela conduit à une efficacité réduite du processus autophagique associée à une forte accumulation d’autophagosomes et à un apport insuffisant de niveaux d’énergie bénéfiques par autophagie (Balmer et al., 2013).

Les principaux objectifs de ce projet de 3 ans sont 1) d’évaluer les effets thérapeutiques des composés antioxydants dans la diminution de la GSH induite par l’hypoglycémie et l’apoptose rétinienne, 2) de mettre en évidence les défauts autophagiques in vivo et 3) de déchiffrer le rôle du stress du réticulum endoplasmique (RE) dans les conditions de faible glucose.

Un contrôle strict de la glycémie, prévenant non seulement l’hyperglycémie mais aussi l’hypoglycémie, est essentiel pour les patients diabétiques pour le maintien d’une bonne fonction rétinienne et d’une bonne vision. Le traitement des patients diabétiques avec des composés antioxydants peut, en outre, aider à maintenir une oxydoréduction stable dans les cellules et à réduire la mort des cellules de la rétine induite par l’hypoglycémie. Par ailleurs, les médicaments pro-autophagiques ou stimulant l’autophagie peuvent représenter de nouveaux axes thérapeutiques à envisager afin de réduire certaines complications du diabète telles que la mort des cellules de la rétine. Ainsi, le but de notre application est d’élucider plus en détail les mécanismes moléculaires activés par l’hypoglycémie qui induisent la mort des cellules de la rétine des souris et les défauts d’autophagie. Ces informations pourraient déboucher sur de nouveaux moyens de prévenir la dégénérescence de la rétine et de diminuer la vue en cas de diabète.

2. Analyse omique de la rétinopathie diabétique légère à sévère (DR) par rapport à l’absence de DR

Contexte. Le diabète sucré ou diabète mellitus (DM) est l’une des principales causes de cécité irréversible dans le monde pour la population en âge de travailler. On estime qu’environ 360 millions de personnes seront touchées par le diabète sucré d’ici 2030. Parmi elles, un grand nombre développera une rétinopathie diabétique (RD) comme effet secondaire. Il est donc crucial de classer les RD dans des catégories allant de la RD non proliférative légère à la RD non proliférative sévère, pour finir par la RD proliférative. En plus des règles établies par le diabète pour cette classification, il sera essentiel de définir précisément chaque stade à l’aide de biomarqueurs.

Projet. Nous proposons d’effectuer des analyses « omiques » sur l’humeur aqueuse (HA) de patients diabétiques affectés par différents stades de la RD non proliférative, de légère à sévère, y compris les patients atteints de RD proliférative. Nous comparerons les résultats avec des patients diabétiques qui ne sont pas affectés par la RD et des patients non diabétiques, comme témoins. Nous effectuerons d’abord des analyses épigénomiques, protéomiques et métabolomiques sur l’hormone de croissance afin de générer une sorte de carte d’identification pour chaque groupe de patients atteints de la maladie. Ensuite, nous évaluerons la présence des biomarqueurs identifiés dans les larmes et le plasma sanguin.

Perspective. La stratification et la classification de tous les patients affectés par la RD en sous-groupes seront possibles avec cette approche et permettront un traitement plus personnalisé afin de donner le bon traitement à la bonne personne au bon moment. De plus, les biomarqueurs identifiés, détectables dans les larmes et/ou dans le sérum plasmatique, permettraient une méthode de test non invasive de ces biomarqueurs chez les patients.

Diabetic Retinopathy (DR)

Raphaël Roduit

1. Role of GSH (Glutathione) in hypoglycemia-induced cell death and autophagy defects

Glucose is the most important metabolic substrate of the retina and maintenance of normoglycemia is an essential challenge for diabetic patients as well as human individuals. Glycemic excursions could lead to cardiovascular disease, nephropathy, neuropathy and retinopathy. A vast body of literature exists on hyperglycemia namely in the field of diabetic retinopathy, but very little is known about the deleterious effect of hypoglycemia. Therefore, we decided to study the role of acute hypoglycemia in mouse retina. We recently showed in two different studies, that hypoglycemia induced retinal cell death in mouse (Emery et al., 2011) and that low glucose conditions are associated with autophagy defects in 661W photoreceptor cells and retinal explants (Balmer et al., 2013).

 Using a hyperinsulinemic/hypoglycemic clamp as paradigm, we showed that hypoglycemia induced retinal cell death in mouse via caspase 3 activation and glutathione (GSH) decrease. In vitro experiments in 661W photoreceptor cells confirmed the low-glucose induction of death via superoxide production and activation of caspase 3, which was concomitant with a decrease of GSH content. Moreover, decrease of GSH content by treatment with buthionine sulphoximine (BSO) at high glucose induced apoptosis, while complementation with extracellular glutathione ethyl ester (GSHee) restored GSH level and reduced apoptosis (Emery et al., 2011). Moreover, we deciphered the mechanism leading to cell death by showing the role of BCL2/BAX ratio in this process. In addition, we showed an activation of the autophagic flux via the AMPK/RAPTOR/mTOR and a defect in the lysosome/autophagosomes fusion process. We also underscored the protective role of autophagy in glucose-induced cell death. In fact, inhibition of autophagy either chemically or genetically, sensitizes cell to low glucose-induced cell death. We suggest that autophagy is activated in photoreceptor cells affected by low glucose in order to protect them from apoptosis/necrosis. Unfortunately, low glucose also affects lysosomal degradation or fusion via a decrease of LAMP2a expression. This leads to a reduced efficiency of autophagic process associated with a strong accumulation of autophagosomes and to an insufficient beneficial supply of energy levels by autophagy (Balmer et al., 2013).

The main goals of this 3-year project is to 1) assess the therapeutic effects of antioxidant compounds in hypoglycemia-induced GSH decrease and retinal apoptosis, 2) highlight autophagic defects in vivo and 3) decipher the role of endoplasmic reticulum (ER) stress in low glucose conditions.

A strict control of glycemia, preventing not only hyperglycemia but also hypoglycemia, is critical for diabetic patients for the maintenance of a good retinal function and vision. Treatment of diabetic patients with antioxidant compounds may, in addition, help to maintain stable redox within the cells and reduce retinal cell death induced by hypoglycemia. Moreover, pro-autophagic or autophagy stimulating drugs may represent new therapeutic axes to consider in order to reduce certain complications of diabetes such as retinal cells death. Thus, the goal of our application is to elucidate in more details the molecular mechanisms activated by hypoglycemia that induce mouse retinal cell death and autophagy defects. This information may lead to new ways of preventing retinal degeneration and decrease eyesight in diabetes.

2. Omics analysis from mild to severe Diabetic Retinopathy (DR) vs no DR

Background. Diabetes mellitus (DM) is among the leading causes of irreversible blindness worldwide in the working age population. Estimates point out that about 360 mio people will be affected by DM by 2030. Among them, a large number will develop a diabetic retinopathy (DR) as secondary effect. Therefore, it is crucial to classify DR into categories ranging from mild to severe non-proliferative DR, ending with proliferative DR. In addition to diabetes-established rules for this classification, it will be essential to precisely define each stage using biomarkers.

Project. We propose to perform “omics” analyses on aqueous humor (AH) of diabetic patients affected by different stages of non-proliferative DR, from mild to severe, including proliferative DR patients. We will compare results with diabetic patients who are not affected by DR and non-diabetic patients, as controls. We will first perform epigenomics, proteomics and metabolomics analyses on AH to generate a kind of identification card for each group of DR patients. Then we will evaluate the presence of identified biomarkers in both tears and blood plasma.

Perspective. The stratification and classification of all patients affected by DR into subgroups will be possible with this approach and will enable a more personalized treatment in order to give the right treatment to the right person at the right time. Moreover, identified biomarkers detectable in tears and/or in plasma serum would allow a non-invasive testing method of these biomarkers in patients.

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